各种转染试剂中文说明

一、PEI Prime Powder, Transfection Grade Linear Polyethylenimine(Serochem)转染步骤（以 HEK293 贴壁细胞为例）

1.细胞接种：细胞密度 2-6 x106 cells/mL.

2.质粒的准备：在 5％最终培养体积的 DMEM 或培养基中，每 10 6 个细胞稀释1.0 ug pDNA。

3. PEI 的准备：在 5％最终培养体积的 DMEM 或培养基中，每 10 6 个细胞稀释3.0 ug PEI Prime，混匀通过快速，短暂涡旋或颠倒数次试管，将 pDNA 和 PEI Prime 溶液混合在一起。

4. 使 pDNA 和 PEI 的混合物在室温下静置 10 分钟。一边旋转板，一边将 pDNA 和 PEI 混合物逐渐滴加到细胞中。

5.于 37℃ CO₂ 培养箱中培养。

二、Effectene Transfection Reagent(Qiagen) 转染步骤：

说明：以下步骤适用于在 6 孔培养板中转染贴壁细胞。开始时，每 6 孔培养板使用 0.4ug DNA。尽管 DNA 的量看起来很少，但已足够用于转染。如果想获得最高的转染效率，对每种细胞系的转染条件都要进行优化。

转染前一天，用 5ml 含血清和抗生素的培养基分装使每 6 孔培养板含 2-8×105的细胞（根据细胞类型而定）。在细胞的正常培养条件下培养（通常 37℃和 5％CO2）。转染当天细胞应 40-80％融合。转染时，用 DNA 浓缩缓冲液（EC Buffer）稀释 1ug DNA 至 100ul 总体积（DNA 用 pH 7-8 的 TE Buffer 溶解，DNA 浓度：0.1ug/ul）。加入 3.2ul Enhancer， 涡旋 1s 以混合溶液。

重要：请保持 DNA 与 Enhancer 比例恒定。

 注意：质粒 DNA 的质量会显著影响几个转染参数如转染效率、细胞增殖和细胞毒性、以及对于结果的解释。因此，只应该使用最高纯度的 DNA。室温（15-25℃）孵育 2-5 分钟，离心（spin down）几秒钟以从管顶去除液滴。向 DNA-Enhance 混合液中加入 10ul Effectene Transfection Reagent，反复吸取 5

次或涡旋 10 秒钟以混合。

注意：没必要一直把 Effectene Reagent 置于冰上。在室温中放置 10-15 分钟不会改变它的稳定性。

室温下（15-25℃）孵育 5-10 分钟以形成转染复合物。孵育过程中，从培养板上轻柔地吸出培养液，用 4ml PBS 洗涤一次细胞。加入1.6ml 新鲜培养液（可以包含血清和抗生素）到细胞中。加入 0.6ml 培养液（可以包含血清和抗生素）至包含转染转染复合物的 EP 管中。吸取两次以混合，立即将转染复合物 drop-wise 加入 6 孔培养板的细胞中。轻摇培养板使转染复合物分布均匀。将细胞与转染复合物在它们的正常培养条件下孵育适当的时间直至转染基因表达。孵育时间和由所采用的实验和所使用的基因决定。

Optional: 大多数情况下，不需去除转染复合物。然而，如果观察到细胞毒性，则需在转染后 6-18 小时移除 Effectene-DNA 混合物，用 PBS 洗涤一次细胞， 然后加入 5ml 新鲜细胞培养液。

瞬时转染时，进一步试验分析转染基因的表达。

转染β-gal 或 cat 报告基因的重组子常在转染后孵育 24-48 小时以使转染基因的表达。

稳定转染时，在转染后 24-48 小时，将细胞以 1:5~1:10 传代至合适的选择性培养基中。保持细胞在选择性培养基中直至克隆出现。

注意：我们推荐对每一细胞系和使用的抗生素建立一个致死曲线（剂量-反应曲线）。但是一定要记住致死曲线受细胞密度的影响。

以下步骤有时是必须的：将转染的细胞置于它们正常的培养液（如：不含选择性抗生素的培养液），然后孵育 1-2 天，然后再加入选择性培养液。