细节决定western blot的结果

细节决定western blot的结果

细节决定成败，western blot更是如此，那让我一一为大家介绍这些细节的地方吧。 

一、 样品准备部分

有好的开始，才会有好的结果。良好的样品的制备，是WB的重中之重，特别是以下几个方面：

1. 时间把控到位

尽管样品的处理浓度可能不同，处理时间也可能不同，无论是孵育的时间还是终止的时间，都要按照预先设计的时间来进行，提前或者推迟，都会影响最终的结果。

2. 防止蛋白降解

防止蛋白降解的方法通常有两种：

（1）低温操作

所有的用具、样品、裂解液等都提前预冷，实验全程在低温（4℃）下操作，可以有效防止蛋白讲解

（2）蛋白酶抑制剂

将蛋白酶抑制剂和PMSF共同使用，能有效防止蛋白降解。

3. 裂解液用量把控精确

裂解液的用量直接决定了细胞裂解程度以及裂解后的蛋白浓度。若裂解液量较少，就会导致蛋白浓度太高，与上样缓冲液反应不充分，电泳后会出现多条条带，条带形状也不好；若裂解液量过多，蛋白浓度被稀释，会导致在胶孔中的上样量不足，条带不清晰。

二、 WB 电泳部分

有了好的开端，再加上好的过程，势必会有好的结果。WB过程中需要注意的细节如下：

1. 制胶

Biorad的制胶试剂盒，让制胶的日子洒满了阳光。

2. 上样

实验不同，上样的总蛋白量稍有不同。若上样体积小的，可用枪头直接上样；若上样体积>20ul，建议采用微量注射器；若上样体积太大，可采取间断上样。

3. 电泳

样品到达分离胶之前，控制电压≤60V，能有效解决样品排列不整齐的问题。样品到达分离胶之后，可调节电压为100V，若时间充足，维持电压在60V以下，效果更好。

4. 转膜

电泳开始后就配置电转液，加入甲醇，预冷。预冷是神助。

我们的实验，有了上述的神助攻的细节，期待你的结果吧。