凯杰Qiagen DNA提取试剂盒说明书

凯杰Qiagen DNA提取试剂盒说明书以QIAamp DNA FFPE Tissue Kit为例来进行说明。

一、实验试剂的准备

步骤一：配置QIAamp DNA FFPE Tissue试剂盒缓冲液

检查Buffer ATL及Buffer AL原液是否有沉淀物形成。有沉淀形成时，须升温至70℃同时适度晃动，使沉淀物全部溶解。

步骤二：配置Buffer AW1

在19ml Buffer AW1原液中加入25ml(96-100%)无shui酒精，盖紧瓶盖并摇匀。在试剂瓶上作已加入无shui酒精的标记，同时须标注配置时间。配置好的溶液可在室温(15-20℃)下保存一年。

步骤三：配置Buffer AW2

在13ml Buffer AW2原液中加入30ml(96-100%)无shui酒精，盖紧瓶盖并摇匀。在试剂瓶上作已加入无shui酒精的标记，同时须标注配置时间。配置好的溶液可在室温(15-20℃)下保存一年。

二、操作步骤

1. 使用刻刀修整石蜡组织上组织周围多余的石蜡。

2. 根据组织大小不同切取10μm厚的石蜡组织切片4~10张。如石蜡标本组织面暴露于空气中时间过长，须舍弃前2~3张石蜡组织切片。

3. 将切取的石蜡组织切片置入已做好标记的1.5ml eppendorf tube中，加入1ml二甲苯。盖紧盖子并使用vortex振荡器充分振荡10s。

4. 使用Thermo离心机在全速状态下离心2min。实验全程须保持在室温状态下进行(15~25°C)。

5. 离心结束后，使用移液器吸取并遗弃上部已溶解石蜡的二甲苯溶液，操作中应注意不要将下方的组织也同时丢弃。

6. 加入1ml 96％~100%无shui酒精，再次vortex振荡器充分振荡。目的是用酒精充分溶解组织中残留的二甲苯。

7. 在室温下全速离心2min。

8. 使用移液器吸取并遗弃上部已溶解二甲苯的酒精溶液，操作中应使用细小的移液器头并应注意不要移去下方荡洗后的组织。

9. 在室温下打开eppendorf tube盖子，静置至所有残余酒精全部挥发。

10. 加入180μl buffer ATL及20μl蛋白酶K，vortex振荡器充分振荡。

11. 封口膜封闭已加入试剂的eppendorf tube，分别将其插入浮漂并置于预先已升温至56°C的水浴锅中。孵育至少一小时或过夜，至组织wanquan裂解完毕。

12. 预先加热另一侧水浴锅至90°C，将56°C水浴锅中组织已wanquan裂解的样本置于90°C水浴锅中，孵育1h。注意应严格控制温度以及孵育时间，过高的温度以及过长的时间可能损害最终所提取DNA的完整。过短时间和较低温度则可能造成福尔马林解铰联不che di，DNA提取总量降低。

13. 1h后将标本取出并低速离心，将eppendorf tube盖子以及侧壁的液体甩入瓶中。待标本冷却至室温时，加入2μl RNase A，用以去除溶液中残存的RNA。

14. 在每个样本中加入200μl buffer AL以及200μl无shui酒精，并立即vortex振荡充分混匀，形成均一的组织溶液。同时也可产生部分白色不溶沉淀，但不影响后期DNA提取。

15. 再次低速离心，将eppendorf tube盖子以及侧壁的液体甩入瓶中。

16. 将包装内的QIAamp MinElute column取出并按照标本次序做好对应的标记。仔细的将eppendorf tube中全部悬液移至QIAamp MinElute column中，操作过程中需注意要将所有液体全部转入吸附柱中，勿浸湿吸附柱与收集管边缘或遗留部分悬液。6000×g (8000 rpm)离心2min，之后将下方收集管中的滤过液以及收集管一并遗弃。从离心机中取出QIAamp MinElute column动作要小心，操作过程中注意防止下方滤过液回流。如果离心2min后仍有部分溶液存在于上方过滤柱内，须采用更高的离心速度以及更长的离心时间再次离心直至过滤柱中wanquan排空。

17. 将离心完毕的吸附柱置于新的收集管中，小心打开盛放样品的吸附柱盖子，分别加入500μl AW1，注意加入洗液时勿浸湿吸附柱与收集管边缘。盖好盖子后6000×g (8000 rpm)离心1min，离心完毕后将下方收集管中的滤过液以及收集管一并遗弃。操作过程中注意防止下方滤过液回流。如果离心1min后仍有部分溶液存在于上方过滤柱内，须采用更高的离心速度以及更长的离心时间再次离心直至过滤柱中wanquan排空。

18. 将离心完毕的吸附柱置于新的收集管中，小心打开盛放样品的吸附柱盖子，分别加入500μl AW2，注意加入洗液时勿浸湿吸附柱与收集管边缘。盖好盖子后6000×g (8000 rpm)离心1min，离心完毕后将下方收集管中的滤过液以及收集管一并遗弃。操作过程中注意防止下方滤过液回流。如果离心1min后仍有部分溶液存在于上方过滤柱内，须采用更高的离心速度以及更长的离心时间再次离心直至过滤柱中wanquan排空。

19. 将离心机调至最高转速至少(20,000×g; 14,000 rpm)，离心3min，甩尽吸附柱内残存的酒精。

20. 重新准备已消毒的对应标记好的1.5ml eppendorf tube，将离心完毕的吸附柱放置于离心管中，并丢弃下方的废液收集管。注意整个过程保持动作平稳，防止下方滤过液回流污染吸附柱。小心打开吸附柱盖子，加入15μl buffer ATE。操作时应注意将ATE直接滴加至吸附膜中央，同时应保证ATE为室温以保证其溶解效率。最终洗脱体积将少于总加入ATE总量约5μl。

21. 盖好瓶盖并静置至少5min，之后将离心机调至最高转速至少(20,000 ×g; 14,000 rpm)，离心1min。

22. 将离心得到的DNA溶液应用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计检测DNA质量及浓度。

23. 将检测合格的DNA保存于-20°C冰箱。