如何处理PCR反应中的污染？

PCR反应的特点是具有较大扩增能力与灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。那么我们该如何处理PCR反应中的污染呢？让我们一起来看看吧！

一、环境污染

1.稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤。

2.紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm,照射30min即可。需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。UV照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA链中所有嘧啶均能形成二聚体，且UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。

在受照射的长DNA链上，形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA链间与链内的交联和DNA断裂等）均可终止Taq DNA聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（0.13/碱基）在DNA分子上随机分布，一个500bp片段的DNA分子链上将有32处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果100bp的片段，每条链上仅有6处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV照射有一定的片段长度限制的原因。

二、反应液污染

1.DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I,室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列。

2.内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如Msp I和Taq I等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行PCR。

3.紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法。

4.g射线辐射法：1.5kGy的辐射可wan全破坏0.1ng基因组DNA,2.0 kGy可破坏104拷贝的质粒分子，4.0 kGy仍不影响PCR,但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR,g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。

三、RS-PCR法（RNA-specific PCR）

也称为链特异性PCR,主要指用于RNA模板的特异性PCR法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的3ˊ端(A区)有2 0个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5ˊ端2 0个核苷酸(C区)为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后，经超速离心使 cDNA与多余引物分开，再用和第二引物(C)以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA,以后的PCR循环中用逆转录引物的B区和引物C进行扩增加尾cDNA,而污染的DNA或质粒DNA才不会被扩增。

四、抗污染引物法

该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。

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