qPCR曲线常见问题有哪些？如何解决？

在 qPCR 实验过程中，经常会遇到异常扩增曲线和熔解曲线的困扰，那么qPCR曲线常见问题有哪些呢？该如何解决呢？让我们一起来看看吧！

一、扩增曲线相关问题

1.无扩增曲线

可能原因：

（1）没有打开荧光信号采集。检查程序设置，三步法扩增程序在 72℃ 延伸阶段采集信号，两步法扩增程序的信号采集设置在退火延伸步骤。

（2）引物降解。可通过 PAGE 电泳检验引物的完整性。

（3）模板浓度低。建议增加模板投入量或重新制备较高浓度模板。

2. 扩增曲线不光滑

可能原因：

（1）仪器长时间未校准，在检测中出现了波动，建议定期校准仪器；

（2）RNA 模板不纯，建议增大模板稀释倍数或者重新制备较高纯度的 RNA 模板。

3. 扩增曲线平台期抖动

可能原因：仪器与管材不匹配导致的信号采集产生波动。

4. 扩增曲线右下方下落呈倒扣状

可能的原因：模板浓度过高，基线终点值大于 CT 值，仪器默认起峰位置仍为基线期，将起峰位置往基线下拉，所以扩增曲线变成了倒扣的 S 形（左图）。可适当减小基线范围，手动调整基线终点值至 CT 值 -4，调整基线范围后，扩增曲线即恢复正常（右图）。

二、熔解曲线相关问题

1. 有扩增曲线无溶解曲线

可能原因：检查是否有设置熔解曲线步骤或熔解曲线信号采集是否打开。

2. 熔解曲线杂峰

（1）杂峰在主峰之前

可能的原因：杂峰在主峰之前，Tm 在 70～75℃ 范围内，一般是引物二聚体。引物二聚体是引物 3’ 端的部分碱基互补结合，在 Taq 酶的作用下，3’ 端延伸后得到的小分子量的双链 DNA 片段。可根据 NTC（无模板阴性对照）判断是否为引物二聚体。

解决方案：建议通过提高模板浓度、提高退火温度、降低引物浓度来改善。

（2）杂峰在主峰之后

可能的原因：非特异性扩增，可能由于引物特异性较差，或体系中有气溶胶污染（可结合 NTC 确定体系是否有污染）。建议先提高退火温度，可提高扩增特异性。如果提高退火温度对于特异性没有改善，建议更换特异性较高的引物。

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