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免疫荧光实验的流程

 更新时间:2024-03-19 点击量:203
  免疫荧光技术是一种建立在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础之上的先进技术。它基于抗原抗体反应的原理,首先将已知的抗原或抗体标记上荧光标签,然后使用这些荧光标记的抗体(或抗原)作为探针,用来探查细胞或组织中的相应抗原(或抗体)。通过荧光显微镜,可以清晰可见荧光信号在细胞或组织中的位置,从而确定抗原或抗体的性质、分布以及通过定量技术(例如流式细胞仪)来测定其含量。这项技术为科学研究和医学诊断提供了强大的工具,使我们能够深入了解生物分子的相互作用和细胞内过程。那么你知道免疫荧光实验的流程有什么吗?让我们一起来看看吧!
  免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。
  一、细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)
  免疫荧光实验的第一步是准备细胞片,而细胞片的质量对整个实验的成功起着至关重要的作用。这是因为,如果在细胞片制备过程中发生细胞掉落或损坏,那么实验将无法继续进行。这一步的关键在于精细处理玻片(Slides或Coverslips)并确保细胞保持活力。只有在这一步骤中细致入微地处理好细胞片,才能为后续的免疫荧光实验奠定坚实的基础。
  具体操作步骤:
  细胞准备。对单层生长细胞,在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,PBS洗两次;对悬浮生长细胞,取对数生长细胞,用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
  二、固定和通透
  最关键的是,必须根据研究对象的抗原性质,明智地选择适用的固定方法。选用正确的固定剂和遵循适当的固定程序,对于获得出色的实验结果至关重要。这是确保实验成功的重要一环,因为固定是为了保持抗原的完整性,使其能够被有效地检测和分析。
  具体操作步骤:
  固定:根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min。
  通透:使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞,一般需要在加入抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min。
  三、封闭和抗体孵育
  与其他方法(例如ELISA或Western Blot)的许多步骤相似,免疫荧光实验的主要区别在于其使用了荧光标记的抗体。因此,在进行该实验时,必须特别注意避光操作,以保持荧光信号的稳定性。此外,抗体浓度的选择在免疫荧光实验中可能具有更加关键的意义,因为它会直接影响到实验结果的质量和解释。
  具体操作步骤:
  封闭:使用封闭液对细胞进行封闭,时间一般为30min。
  一抗结合:室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次,每次冲洗5min。
  二抗结合:间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次,每次冲洗5min后,再用蒸馏水漂洗一次。
  四、荧光检测
  最后需要注意的是,标记好荧光的细胞片应尽早观察,或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存,以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
  具体操作步骤:
  封片及检测:滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查。
  更多有关免疫荧光实验的流程,请联系北京百奥创新科技有限公司。