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qPCR实验常见问题及解决方法

 更新时间:2024-04-01 点击量:295
 PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称,是一种选择性体外快速扩增DNA片段的方法。在体外以类似于细胞内DNA的半保留复制过程,以拟扩增的模板DNA分子,与模板DNA互补的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4dNTP及适合的缓冲体系组成的反应体系,经过重复地变性一退火一延伸三步,扩增新的目的DNA链,这个过程通过控制反应体系的温度来实现。可以在短时间内将微量的DNA片段扩增到足够数量,用于后续的研究和检测。下面让我们一起来看看qPCR实验的常见问题及解决方法吧!

一、扩增曲线不稳定

可能原因

RNA纯度低;体系中存在较多杂质;仪器使用时间过长。

解决方案

1)提取高纯度的RNA,小心操作。

2)对仪器进行校准。

二、扩增无法达到平台期

可能原因

模板浓度太低;循环数太少;试剂扩增效率低。

解决方案

1) 提高模板量

2) 提高循环数

3) 用标准曲线测定扩增效率,提高镁离子浓度,换用扩增效率高的试剂。

三、荧光下降

可能原因

存在降解;模板浓度过高。

解决方案

1) 提高体系纯度

2) 降低模板量

3) 降低荧光阈值

四、单峰、峰不尖锐

可能原因

与试剂成分有关;或存在大小相近的非特异性扩增。

解决方案

1) 温度跨度不高于7度,视为可用结果

2) 进行高浓度琼脂糖电泳,确认是否为单一条带。

五、单峰,Tm低于80

可能原因

只有引物二聚体,无目的条带;或扩增片段过短。

解决方案

1) 检查是否加入模板

2) 进行琼脂糖电泳检测,确定条带大小是否正确

六、双峰,较低峰Tm80度之前

可能原因

由于模板浓度过低或引物浓度过高使多余引物形成引物二聚体。

解决方案

1) 适当提高退火温度

2) 提高模板量,降低引物浓度

3) 重新设计引物。

七、qPCR注意事项

·提高样品纯度,尽量减少样品之间的交叉污染。

·每个样品至少要做3个平行孔,以防在 后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。

·MasterMix不要反复冻融,如果经常使用,最好融解后放 在4℃;配置体系时在冰上操作;减少加样误差,每管或每孔都要换新枪头,不要连续用同一个枪头加样;所有成分加完后,离心去除气泡。

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