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常见的膜蛋白提取方法

 更新时间:2024-04-24 点击量:114
  细胞膜是一种特殊生物膜,不仅保证了细胞内各种生理反应有序进行,也实现了物质、能量和信号的正常传导,其大部分功能依靠细胞膜上的膜蛋白完成。膜蛋白提取的难点较多,主要原因是膜蛋白在生物体内的表达水平较低,具有强的疏水特性,并且通常在实验条件下难以维持正确构象。下面让我们一起来看看常见的膜蛋白提取方法都有什么吧!
  一、先分离膜,然后提取
  如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎,然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。
  (例如:michael11液氮研磨组织→加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂→差速离心→蔗糖密度梯度离心→收集37%与41%间的成分,即为质膜部分→裂解即可收集膜蛋白)。
  二、用特殊的去污剂选择性的分离
  采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来,然后将蛋白质稳定。去垢剂的选择通常是依据对所需要蛋白质的提取效率来确定,但在某些情况下,还要考虑到以后的纯化步骤。虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化,但最终仍可能需要除去去垢剂。在设计膜蛋白溶解方案时,必须考虑某一去垢剂的特殊性质。如tritonX-100在280nm处有吸收,如果某蛋白质的测试与280 nm处的吸收有关,就应避免使用这类去垢剂。将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后,再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来。这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白,而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入。使用这种方法所获得的膜蛋白,无论在种类上还是数量上,都比酸溶解法所得到的蛋白(<5000 Da)要多。
  一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足0.1%,所以充分的膜蛋白的提取,无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的。第二种方法简单,可靠,但有时含有其他蛋白。一般的都是利用4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX-114水溶液,在温度超过20度时,此溶液分为水相和去污相;此时亲水性蛋白溶于水相,疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此性质可提取膜蛋白。
  三、膜蛋白色谱(CMP)
  CMP+分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统,一般有去垢剂(如SDS)溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白,并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团(P-端),又具有阳离子钙(C-端),与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现,样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换,从而达到分级分离的目的。
  四、离心柱法提取膜蛋白
  高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后,超高速离心。
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