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一步法RT-qPCR实验优化小技巧

 更新时间:2024-05-16 点击量:265

常见的RT-qPCR流程一般分为RNA提取,逆转录、荧光定量PCR三个步骤,当有的课题需要对某物种进行多种处理后,检测某个基因的表达水平,以验证该基因应对不同胁迫压力的耐受力;或者经某种病原菌侵染后,检测寄主不同基因的表达水平,以探究可能涉及的通路及互作机理等……对于这几类样本数量较大,但样本只需要检测一次的实验方案,我们常常推荐一步法RT-qPCR,即逆转录与荧光定量PCR配制一管体系,只需一次上机即可完成表达量的检测。

由于将RNA逆转录与荧光定量PCR的体系配制合为一步,那么对于实验操作的精准度及污染控制就极为重要,针对一步法RT-qPCR的特殊性,以下总结了一步法RT-qPCR实验优化技巧可有效提高实验结果的稳定性及准确性。

1. 目的片段选择

① 选择80-200 bp扩增子可保证PCR扩增效率zui大化

② 片段GC含量建议控制在40% ~ 60%

③ 避免扩增子与模板其他位置出现长片段的重复序列

④ 避免扩增子出现二级结构

2. RNA模板制备

① 尽量选择高产量、高纯度的RNA提取试剂

② RNA可以保存在含有EDTA溶液 (1 × TE) 中,EDTA可螯合金属离子来消除对RNase的催化作用,以此保证RNA的完整性

③ RNA提取后可以使用DNase I (ATG #E103) 消化基因组DNA残留

3. 引物设计

① 常规引物长度15-30 nt,理想的引物GC含量40-60%Tm值尽量接近60℃,且上下游引物Tm值相差尽量3℃以内,避免4个重复性的碱基序列,尤其是4G碱基

② 引物浓度按说明书推荐值添加,引物投入量过多,可能产生引物二聚体或非特异扩增,熔解曲线会出现杂峰

③ cDNA为模板时,建议引物区域跨越内含子,这样减少以基因组DNA模板进行扩增的假阳性

4. 探针设计

① 常规探针长度15-30 nt,以保证荧光基团能够有效猝灭,GC含量保持40-60%

② 一般情况下,非荧光猝灭基团比荧光猝灭基团更有信噪比

③ 避免5’端为G碱基,否则会猝灭荧光基团

④ 设计的探针应该结合到正义链或反义链上

⑤ 一般探针Tm值要比引物Tm值高5-10℃,保证引物结合前探针的全部序列与模板充分结合

5. 多重扩增

① 避免探针、引物之间及目的序列之间没有重叠序列

② 设计探针时,保证每个目的序列有唯yi的用于检测的荧光基团

③ 根据实时定量PCR仪检测范围来选择荧光基团,荧光报告基团的发射光谱不能有重叠

④ 在单重反应中检测每一组引物/探针组合,以设置一个基线标准,确保在多重PCRCt值接近

⑤ 高丰度目的序列可搭配低强度荧光染料,低丰度目的序列则搭配高强度荧光染料

6. 逆转录

 

① 一般建议逆转录这一步的反应温度按照试剂说明书设置,对于具有复杂二级结构或高GC区域的模板,建议提高反应温度,有助于提升扩增效率和灵敏度。

7. 循环条件

① 一般情况下,按照说明书中的循环条件即可达到最佳效果

② 可以进行较长片段扩增 (>400 bp),但可能需要优化延伸时间

③ 对于大多数情况,40个循环是足够的,极低起始量的可以进行45个循环

8. 建立反应

① 为了达到最佳结果,在热循环之前请将反应体系放在冰上

② 对于96孔板,推荐使用20 μl反应体系。使用384孔板,推荐10 μl反应体系

③ 每一个样本应设置三个重复,保证每一个扩增子包含阴性对照 (NTC)

④ 为了避免交叉污染,热循环前加入热敏UDG37℃处理10 min

9. 检测评估

① 确保至少三个10倍梯度稀释模板的扩增效率达到90-110%,相关系数(R2) >0.99

② 通过产物的长度、测序或熔解曲线分析确认其特异性

以上就是有关于一步法RT-qPCR实验优化技巧的全部内容,如果你想了解更多请咨询百奥创新客服!