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脂质体转染的原理与方法

 更新时间:2024-05-17 点击量:122
  脂质体作为体内和体外输送载体的工具,已经研究的十分广泛,中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA,借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体,DNA并没有预先包埋在脂质体中,而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上,形成DNA-阳离子脂质体复合物,从而吸附到带负电的细胞膜表面,经过内吞被导入细胞。下面让我们一起来看看脂质体转染的原理与方法吧!
  脂质体转染操作步骤
  进行实验之前,请先规划好实验,一般细胞转染需要24h-72h,所以要充分了解细胞生长速度,计算所需脂质体和DNA的储备量,并确认准备好所需试剂:Opti-MEM无血清培养基,Lipofectamine转染试剂,以及DNA。
  1、细胞铺板
  (1)一般会选择复苏细胞传代3-4次,从解冻过程中恢复过来可以稳定生长的细胞进行细胞转染,传代次数高(>30-40)时,细胞的生长速度和形态会改变。
  (2)如果提总蛋白,一般选择六孔板进行转染,因为转染的细胞提取蛋白的总量能达到200ug,一般够做并且需要的DNA和Lipofectamine又相对比较少。
  (3)传代条件取决于所用的细胞系。对于快速生长的细胞,倍增时间为16小时(如HEK293)。对于生长缓慢的细胞,倍增时间为36小时(如原代细胞)。
  (4)转染当天,将细胞铺板。如果在转染前一天或更早时间铺板,转染效率可能下降,如果是简单细胞系的转染,可以直接在前一天晚上铺板,第二天来转染。转染时,细胞密度会影响转染效率,细胞密度保持在汇合率为70-90%(这个前提是转染24h,如果转染48h则需要汇合率为50-70%),细胞的铺板和转染也可同时进行。
  2、细胞转染
  吸去培养皿中的培养基,用PBS或者无血清培养基清洗一次。更换无血清培养基。准备转染制备液,用灭菌后的EP管制备。以六孔板为例,A液:用200μl Opti-MEM稀释4μg质粒;B液:用200μl Opti-MEM稀释10μl lipo2000,分别将A液、B液轻轻混匀,静置5min,吸取B液加入至A液中,轻轻混匀,室温静置20min。加入转染试剂到每个孔的培养基中,6h后,更换成完q培养基,继续培养到24-48小时(不同的质粒和脂质体最佳搭配比例不同,转染前,应该摸一个最佳配比。质粒:脂质体=1:1,1:1.5,1:2,1:2.5,1:3,1:3.5的梯度比例来检测最佳转染比例,一般质粒有带荧光,可以通过观察每组荧光强弱来判断转染效率)。以下为不同规格的培养板需要加DNA和lipo2000的量。
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