免疫组化（IHC）SP法，原来如此简单！

免疫组化，是应用免疫学基本原理-抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。

一、SP法步骤

1. SP三步法

脱蜡→梯度水化→灭活内源性过氧化物酶→抗原修复→封闭→一抗孵育→二抗孵育→SP反应→DAB显色→苏木素复染→常规脱水→透明→封片

2、免疫组化的关键环节

①脱蜡和水化

②抗原修复

③灭活内源性过氧化物酶和生物素

④血清封闭

⑤一抗和二抗浓度和孵育时间

⑥切片清洗(浸洗、冲洗和漂洗)

⑦DAB显色

⑧复染

⑨脱水透明

⑩封片

二、异常分析

1、非特异性染色

①抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。

②一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体。

③内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高(含血细胞多的组织)，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色。

④非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果。

⑤DAB孵育时间过长或浓度过高。

⑥PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤为重要。

⑦标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

2、呈阴性结果

①抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索最佳浓度。

②抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合。

③组织切片本身这种抗原含量低。

④血清封闭时间过长。DAB孵育时间过短。

⑤细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。

三、重要信息

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