Protein A/G 亲和层析法纯化单克隆抗体原理、步骤及注意事项

简介

目前约 70％ ~ 80％ 的抗体纯化使用 Protein A/G 亲和层析法。Protein A 与 IgG 的结合强度很大程度上依赖于该抗体的种属和亚类，而 Protein G 对于大多数哺乳动物的 IgG 则有着更高的亲和力，因此，Protein G 可用于纯化不能与 Protein A 很好结合的哺乳动物单抗或多抗 IgG 的纯化。

原理

Protein A/G 亲和层析法纯化单克隆抗体的基本原理是 Protein A/G 能特异性地与抗体的 Fc 段结合，因此 Protein A/G 亲和层析柱可用于抗体（单抗和多抗）的分离纯化，具有很高的选择性。经过一步亲和层析，即可从腹水、杂交瘤培养上清或免疫血清等样品中得到高纯度（＞ 95％）的抗体。

材料与仪器

器材：

Protein A/G 亲和层析柱，FPLC 层析系统

试剂：

上样缓冲液：0.02 mol/L PBS，pH 7.4

洗脱液：pH 3.0~4.0、0.02 mol/L 柠檬酸缓冲液或 pH 3.0、0.2 mol/L 甘氨酸 -HCL 缓冲液

再生液：0.1 mol/L 乙酸

步骤

Protein A/G 亲和层析法纯化单克隆抗体的基本过程可分为如下几步：

A. 样品预处理：小鼠腹水于 4 ℃、12000 r/min 离心 15 分钟，以除去较大的凝块。经上样缓冲液倍比稀释后，0.45 μm 滤膜过滤。

B. 平衡：以 1 mL/min 的流速，用 5-10 倍层析柱体积的上样缓冲液平衡层析柱，至流出液 pH 值为 7.4。

C. 上样：预处理过的腹水上层析柱，保持 1 mL/min 流速，继续用上样缓冲液流洗 5～10 倍层析柱体积至基线稳定（即杂蛋白wan全洗脱）。

D. 洗脱：用洗脱液洗脱柱结合抗体，同时应用 FPLC 层析系统进行实时监测，当观察到基线开始上升，即出现洗脱峰时，每管 3 mL 收集流出液，直至洗脱峰回到基线，并立即用 1.0 mol/L pH 9.0 的 Tris-HCL 缓液调整收集的各管流出液 pH 值至 7.0。

E. 再生：保持 1 mL/min 流速，用 3～5 倍层析柱体积的再生液淋洗柱子。

F. 平衡：继续用 5～10 倍层析柱体积的上样缓冲液重新平衡层析柱，至流出液的 pH 呈中性，再用 10 倍层析柱体积的三蒸水平衡，可重复使用。
G. 浓缩：合并调至中性的各管洗脱液，采用超滤离心管进行浓缩，最后以 0.15 mol/L PBS（pH 7.4）调整到合适体积，进行 SDS-PAGE 鉴定纯度，BCA 法进行抗体定量，分装冻存。

注意事项

1. 纯化前所有缓冲液、样品及层析柱都必须平衡至室温，以避免产生气泡。

2. 纯化前样品、缓冲液须用 0.45 μm 滤膜过滤去除颗粒性物质，以防层析柱被堵塞而降低纯化效果。

3. 使用经饱和硫酸铵粗纯的样品不仅可获得更好的纯化效果，还可适当延长亲和层析柱的使用寿命。

4. 加样后，让样品在亲和柱内滞留一定时间（约 30 分钟）可提高亲和柱的纯化效率。

5. 在酸性条件下洗脱的抗体必须立即中和到中性（pH 7.0 左右），以利于维持抗体的生物学活性，避免抗体失活。

6. 在使用和保存层析柱时，应避免柱内液体流干，以防气泡进入。

7. 为确保层析柱的使用寿命和载量，及时清洗非常重要，清洗完成后用上样缓冲液重新平衡。

8. 层析柱可于 4 ℃、20％ 乙醇中长期保存。

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