利用Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析法分离纯化 IgG1

简介

Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析法纯化 IgG1 是利用在中性 pH 环境中 Q SepharoseFast Flow 更倾向于结合小鼠腹水中的非目的蛋白，故在用盐溶液梯度洗脱时，McAb 会较早被洗脱或出现在穿过液中，从而可得到分离纯化的 IgG1。

原理

Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析法纯化 IgG1 的基本原理是 Q Sepharose Fast Flow 为强阴离子交换介质，具有流速快（最高流速 750 ml/min）、高量（120 mg HAS/ml）的特点。

小鼠 IgG1 的 PI 范围为 pH7.0～8.5，而白蛋白和转铁蛋白的 PI 范围为 pH4.7-5.0，因此，在中性 pH 环境中 Q SepharoseFast Flow 更倾向于结合小鼠腹水中的非目的蛋白。故在用盐溶液梯度洗脱时，McAb 会较早被洗脱或出现在穿过液中，从而可得到分离纯化的 IgG1。

材料与仪器

器材：0.45μm 滤膜、XK 16/20 层析柱，FPLC 层析系统。

试剂：

① Q Sepharose Fast Flow 强阴离子层析分离填料。

② 起始缓冲液：0.02mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH7.5。

③ 洗脱缓冲液：1.0mol/L NaCl-0.02mol/L Tris- HC1 缓冲液，pH7.5。

④ 再生溶液：0.1mol/L NaOH。

步骤

Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析法纯化 IgG1 的基本过程可分为如下几步：

（1）样品准备

A 小鼠腹水离心去杂质，饱和硫酸铵盐析并除盐，0.45μm 滤膜过滤。

（2）分离纯化

A 按照 Q Sepharose Fast Flow 生产厂家提供的说明书处理填料，按照 XK 16/20 层析柱使用说明书进行装柱。

B 以 5 ml/min 的流速，用起始缓冲液充分平衡层析柱，至流出液的 pH 值与初始缓冲液相同，约 3 倍层析柱体积，走出一稳定基线。

C 上样后，采用 2 ml/min 的流速，以 2-3 倍层析柱体积的起始缓冲液洗掉非结合蛋白，即穿过液中检测不到蛋白峰。

D 以 5 ml/min 的流速加入洗脱缓冲液，则 NaCl 浓度形成连续梯度，IgG1 将首先被洗脱而流出层析柱。

E 纯化的 McAb 可经超滤离心管浓缩，BCA 法测定 McAb 蛋白含量，分装冻存。

F 洗脱结束后，以 5 ml/min 的流速，2-5 倍层析柱体积的再生溶液对层析柱进行再生。用初始缓冲液重新平衡层析柱，以备下次使用。

注意事项

1.纯化前所有缓冲液、样品及层析柱都必须平衡至室温，以避免产生气泡。

2.纯化前样品、缓冲液须用 0.45μm 滤膜过滤去除颗粒性物质，以防层析柱被堵塞而降低纯化效果。

3.不同类 McAb 的等电点变化范围较大，即使在同一类的不同亚类 McAb 之间，其等电点也有较大差异（表 1-3）。因此，在纯化不同类或亚类的 McAb 时，还须进行纯化条件的优化。

4. 为确保层析柱的使用寿命和载量，及时清洗非常重要，清洗完成后用起始缓冲液重新平衡。

5. 层析柱可于 4℃、20％ 乙醇中长期保存。

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