刀豆素 A 亲和柱纯化蛋白质的原理、步骤及注意事项

原理

用于亲和层析的凝集素应根据它们结合的特异性和紧密度加以选择。例如，刀豆素 A（Con A）与糖蛋白含有的葡萄糖或甘露糖结合，而麦芽凝集素只与具 N-乙酰葡糖胺的蛋白质结合。胞膜糖蛋白常与麦芽凝集素结合，而可溶性糖蛋白却通常用 Con A 或扁豆凝集素亲和柱纯化。由于在许多情况下被纯化的糖蛋白的结构和特性不清楚，所以筛选一些凝集素与目的蛋白的结合状况常常是有用和必要的。用于此目的的凝集素试剂盒也可购得。

凝集素亲和层析相对易于操作。可用许多方法将凝集素固相化到介质。溴化氰偶联是普遍采用的方法。每 ml 介质材料能偶联凝集素。偶联时含有适宜的二价离子（0.1 mmol／L）和保护性糖类（5％，w／v）是关键。保护性糖类在偶联过程中使结合部位不易接近而受到保护。许多凝集素亲和柱也可从市场购得。

以下步骤以介绍刀豆素 A 亲和柱纯化蛋白质为例，其他凝集素亲和柱的纯化步骤基本相似，只要换成适宜的洗脱用糖。相对长而细的层析柱有更好的分辨率，短而粗的柱子在小体积洗脱时具有更快的流速。小的试验柱（例如装填在巴斯德吸管内的）或在小离心管内进行的层析试验可用于估算柱的结合容量。

材料与仪器

糖蛋白样品液
甲基-α-D-甘露糖 NaCl NaN3 Tris-HCl NaCl Mncl2 CaCl2 辛糖苷
层析柱

步骤

1. 制备刀豆素 A 亲和柱；

2. 用 10 倍柱体积的层析缓冲液（20 mmol／L ，pH 8.0 Tris-HCl，0.15 mol／L NaCl，1 mmol／L MnCl2，1 mmol／L CaCl2，30 mmol／L 辛糖苷）平衡装好的亲和柱；

3. 糖蛋白样品液对层析缓冲液透析或用该缓冲液 1：1稀释，然后离心或过滤除去沉淀；

4. 将调整好的糖蛋白样品液上样到亲和柱；

5. 用层析缓冲液洗柱至 A280 值回到基线；

6. 用 5 倍柱体积含10 mmol／L 甲基-α-D-甘露糖的层析缓冲液洗脱；

7. 继续分别用 5 倍柱体积含 20、50、100、250和 500 mmol／L 甲基-α-D-甘露糖的层析缓冲液洗脱；

8. 检测目的蛋白组分。汇集的目的蛋白组分透析除去糖；

9. 用含 1 mol／L NaCl 的层析缓冲液洗柱，以获得再生；

注意事项

一些凝集素在它们的结构整合中需要某些二价离子。因为凝集素亲和层析常常涉及膜蛋白质，故经常需要去垢剂以保持这些蛋白质的可溶性。虽然凝集素对非离子型去垢剂相当宽容，但是离子型去垢剂减少它们的特异结合。

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