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PCR反应体系包括什么

 更新时间:2024-06-06 点击量:102
  PCR是一种选择性体外快速扩增DNA片段的方法。在体外以类似于细胞内DNA的半保留复制过程,以拟扩增的模板DNA分子,与模板DNA互补的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4种dNTP及适合的缓冲体系组成的反应体系,经过重复地变性一退火一延伸三步,扩增新的目的DNA链,这个过程通过控制反应体系的温度来实现。那么你知道PCR反应体系包括什么吗?让我们一起来看看吧!
 
  一、模板(template)
 
  模板即扩增用的DNA,可以是任何来源DNA(如基因组DNA、质粒DNA等)或RNA(如总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA等),但必须符合两个条件:一是纯度必须较高,二是浓度不能太高以免抑制。模板是待扩增的目的基因或特异片段,如诊断病人是否携带有突变基因时,其模板就是提取的病人血液中的DNA或RNA片段。PCR对模板DNA的纯度不要求很高,但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在,如蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。
 
  二、引物(primers)
 
  人工合成的一对引物可以分别与两条模板DNA互补结合的寡核苷酸序列,其中一条称为上游引物,另一条称为下游引物。引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物浓度一般为0.1~0.5umol/L,浓度过高会引起错配和非特异扩增,浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般为15~30bp,引物过长或过短都会降低特异性。其3'末端一定要与模板DNA配对,末位碱基最好选用A、C、G(因T错配也能引发链的延伸)。引物GC占45%~55%,碱基应尽量随机分布,避免嘧啶或嘌呤堆积,两引物之间不应有互补链存在,不能与非目的扩增区有同源性。
 
  三、底物(dNTP)
 
  dNTP包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1mol/L NaOH或1mol/L Tris-HCl的缓冲液将其pH调节至7.0~7.5,小量分装,-20℃冰冻保存。一般存储浓度为10mo/L,各成分以等当量配制,反应终浓度为20~200umol/L,如其中任何一种浓度不同于其他几种时(偏高或偏低),就会引起错配。高浓度可加速反应,但同时增加错误掺入和实验成本;低浓度可提高精确性,而反应速度会降低。
 
  四、PCR缓冲液(PCR buffer)
 
  缓冲液的成分最为复杂,除水外一般包括四种有效成分:①缓冲体系,一般使用HEPES或MOPS缓冲体系;②一价阳离子,一般采用钾离子,但在特殊情况下也可使用铵根离子;③二价阳离子,即镁离子,根据反应体系确定,除特殊情况外不需调整;④辅助成分,常见的有DMSO、甘油等,主要用来保持酶的活性和帮助DNA接触缠绕结构。
 
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