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蛋白表达的常见问题

 更新时间:2024-06-19 点击量:458
  蛋白表达实验的时,有时候实验会觉得参考实验方法和克隆的蛋白基因序列完q没有问题,但蛋白电泳就是没有结果。那么你知道蛋白表达的常见问题有哪些吗?让我们一起来看看吧!
  1、载体构建错误,很多克隆新人常常弄错读码框。比如Qiagen的pQE系列载体,其复制位点常有一两个碱基的差异;另外有些酶产生粘端有些酶产生平端,这些都容易导致读码框错误,从而无法表达出来。
  2、宿主菌选择不当。不同的宿主菌其基因型是不同的。有些经过特殊修饰的载体,或者特殊用途的载体,或者有特殊启动子的载体,必须选择适合的宿主菌进行表达。因此,当你的蛋白没有表达出来时,可以考虑更换宿主菌。
  3、密码子的使用频率较低。有些基因其本身含有许多罕见密码子,尤其是起始密码之后的15个碱基之内的罕见密码子,对蛋白表达有着很重要的影响。优化密码子对原核表达似乎效果很好,对真核表达系统未必有很好的效果。
  4、质粒不稳定或者质粒丢失。pET系统通常相对较稳定。但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时,也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素,使质粒丢失。还有一种情况是表达重组的毒素蛋白,对宿主细胞也具有毒性,导致质粒丢失。这种情况在真核表达系统中较为常见。
  5、蛋白酶将蛋白降解了。这种情况通常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起。当蛋白N-端是Arg,Leu,Lys,Phe,Trp,或Tyr这些氨基酸时,容易受到蛋白酶降解,这就是所谓的N-末端规则。如果N-端是Met时,大肠杆菌可以偷偷地将这个Met去掉,尤其是Met之后紧跟着一个带有小侧链的氨基酸时。而C-末端存在非极性氨基酸时,也容易导致蛋白被降解。如果C末端最后5个氨基酸是极性的或者带电荷的,则不容易被降解。
  6、二级翻译起始位点。这种情况出现在你的序列中恰好包含与核糖体结合位点完q相同的序列。那就怪不得了,核糖体会非常高兴地找到这个位点,然后开始翻译,导致你的蛋白被截短,在电泳时无法看到预期大小的片段。
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