一文了解WB-BCA法

一、BCA法的原理

BCA法又被称为Smith法，是由Pierce公司的Paul K. Smith等人在1985年对Lowry法进行改进，提出用BCA代替Folin-酚试剂而建立的（Smith, P.K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 1985, 150: 76-85.）。该方法的原理是，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与Cu²⁺络合，同时将Cu²⁺还原为Cu⁺，BCA螯合Cu⁺形成紫色络合物，测定562 nm 的 OD 值来计算蛋白质浓度。

二、BCA如何与蛋白质反应

那双缩脲反应是如何进行的？又是如何将Cu²⁺还原为Cu⁺的？

双缩脲反应原理:

首先，脲就是尿素，两分子尿素在一定的条件下（180℃左右加热），生成一个分子氨（NH3）缩合得到双缩脲。正是因为该物质是由两分子脲缩合而成的，故名双缩脲。双缩脲在碱性溶液中能与极稀的硫酸铜溶液形成紫色络合物，这个呈色反应叫做双缩脲反应。

双缩脲试剂最初是指能够提供碱性条件和铜离子、用以鉴定或检测双缩脲存在的试剂。由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，故可用双缩脲法测定蛋白质的含量。

那为什么双缩脲反应要在碱性条件下？

蛋白质双缩脲反应实质是肽键络合Cu²⁺，肽键是酰胺键的一种，其pKa大约为-0.5，当pH=-0.5时，有50%酰胺质子化，当pH-pKa＞2时，几乎所有酰胺都去质子化。在强碱（pH 11.25）条件，可以促使肽键中N上的H⁺部分电离，电子云密度增大，易于和Cu²⁺配位，形成紫色螯合物。

BCA是如何螯合Cu⁺的？

当Cu²⁺被蛋白还原成Cu⁺，Cu⁺与蛋白质肽键的络合能力变弱，此时BCA竞争性、特异性地络合Cu⁺，形成稳定的紫色络合物。

三、BCA测定蛋白浓度流程

1. 所需试剂：

BCA试剂（常温保存），Cu试剂（常温保存），PBS（磷酸缓冲液）（常温保存），BSA（牛血清白蛋白）标准品-5mg/mL（-20℃保存）

2. 检测方法：

微孔酶标仪法

3. 实验步骤：

（1）工作液配制：

根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀（混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失）。BCA工作液室温24小时内稳定（建议现配现用）。

（2）标准品稀释：

取10μLBSA标准品用PBS稀释至100μL，使终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0，2，4，6，8，12，16，20μL加到96孔板的蛋白标准品孔中，各孔加PBS补足至20μL。

（3）样品稀释：

将样品作适当稀释（最好多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释），加20μL到96孔板的样品孔中。（由于移液器在取小量样品时误差偏大，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后）

（4）含量测定：

各孔加入200μL BCA工作液，盖上96孔板板盖，于37°C放置15-30min。用酶标仪测定A562nm。将各稀释浓度标准品的A562nm处数据导入Excel，做散点图，得出标准曲线公式，根据标准曲线公式计算出未知蛋白的浓度。

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