蛋白定量方法选择：BCA与Bradford法的干扰因素

裂解液里有什么，决定了该用哪种蛋白定量方法。BCA法与Bradford法的原理不同，对常见缓冲成分的耐受性正好相反，选错方法会得到严重偏离真实值的读数，而且这种偏差往往不自知。一、BCA法的原理与适用面BCA法基于两步反应：蛋白在碱性条件下将二价铜离子还原为一价，一价铜再与二喹啉甲酸螯合形成紫色复合物，在562nm附近有吸收。由于反应依赖肽键，不同蛋白之间的响应差异相对较小，线性范围较宽，适合浓度跨度较大的样本。它对去污剂有较好的耐受性，常规浓度的Triton、Tween、N...

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ELISA样本前处理：血清、血浆与细胞上清的处理差异

同一个试剂盒，换一种样本类型，结果可能差出两三成。多数ELISA定量偏差的根源不在板内反应，而在样本进入反应体系之前的处理环节。血清、血浆、细胞培养上清三类样本的采集与处理要求各不相同，混用处理方式会引入系统性误差。一、血清样本的采集与分离血清需自然凝固后离心获取。常规做法是采血后室温静置30分钟左右待凝固物充分收缩，再以1000至2000g离心10到15分钟取上清。若凝固时间不足，纤维蛋白未充分析出，离心后上清中残留的纤维蛋白可能在后续孵育中析出，造成假性浑浊甚至堵塞加样针...

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Annexin V/PI双染检测细胞凋亡的操作要点

AnnexinV与碘化丙啶双染是检测早期细胞凋亡的常用组合。原理不复杂，但操作细节对结果影响很大——一个消化过度或者缓冲液配错，就足以让凋亡比例虚高好几倍，而实验者往往误以为是处理组真的诱导了凋亡。一、两个探针分别报告什么正常细胞膜内侧分布着磷脂酰丝氨酸，凋亡早期这种磷脂会翻转到膜外侧，成为吞噬细胞识别凋亡细胞的信号。AnnexinV是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，能特异地与外翻的磷脂酰丝氨酸结合，因此被用作早期凋亡的标志。碘化丙啶则是一种不能穿透完整细胞膜的核酸染料，只有膜完整...

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DNA与RNA定量：紫外吸收法与荧光染料法的差异

核酸定量是分子生物学实验的日常步骤，但两种主流方法给出的数值经常对不上。紫外吸收法读数偏高、荧光染料法读数偏低，是常见现象。理解两者测的到底是什么，才能判断该信哪个数。一、紫外吸收法测的是什么紫外吸收法基于碱基在260nm处的吸收峰。经验换算关系为：双链DNA每毫升1个吸光度单位约对应50微克，单链DNA约33微克，RNA约40微克。这个方法的本质是测定所有在260nm有吸收的物质总量，包括完整核酸、游离核苷酸、单核苷酸、以及部分具有共轭结构的杂质。也就是说，它无法区分完整长...

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重组蛋白表达标签的选择：His、GST与Fc的差异

在重组蛋白表达体系中，融合标签的主要作用是方便纯化和检测。不同标签在分子量、对目标蛋白性质的影响、可配套的纯化介质以及后续是否容易去除等方面差别明显。选型阶段把这几项想清楚，可以避免表达成功后却发现纯化困难或标签干扰功能验证的情况。一、His标签：通用性较强His标签通常由6个组氨酸残基组成，分子量小，对目标蛋白的构象和活性影响相对有限，因此应用面较广。纯化依靠金属螯合亲和层析，配套介质选择多、条件成熟。它的局限在于特异性依赖组氨酸与金属离子的配位作用，若裂解液中存在较多带组...

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